El juego se abre con Nathan Drake (Nolan North, voz inglesa) quien recupera el ataúd del explorador y ancestro de Nathan (tal como él mismo dice), Sir Francis Drake desde el fondo del océano, utilizando las coordenadas inscritas en un anillo en posesión de Nathan. El esfuerzo se paga a través de la empresa de la periodista Elena Fisher (Emily Rose), que está ahí para registrar los acontecimientos para un posible documental exitoso. El ataúd está vacío, sin cadáver, sólo contiene un diario escrito por Sir Francis Drake, sino que apunta a la ubicación de El Dorado, la legendaria ciudad de oro donde Sir Francis se fue a encontrar el tesoro, demostrando su falsa muerte como Nathan creía. Súbitamente son atacados por una banda de piratas que perseguían a Nathan y destruyen el barco, pero ambos son rescatados por el compañero de Nathan, Victor "Sully" Sullivan (Richard McGonagle). Más adelante se revelará que estos piratas estaban liderados por Eddy Raja (Sie James), un viejo rival de Nathan.
Nathan y Sully vuelan a América del Sur sin Elena y encuentran pistas de que El Dorado no es realmente una ciudad, sino una gran estatua de oro, y que la estatua se ha retirado de donde se mantuvo desde ya hace un largo tiempo. Sin embargo, Nathan y Sully descubren un abandonado U-boat cerca, con la tripulación muerta y sus bolsillos llenos de oro y una página desaparecida del diario de Drake que apunta a una isla tropical del sur, donde es probable que esté la estatua. Sin embargo, antes de que puedan salir hacia la isla, Nathan y Sully son abordados por Gabriel Roman (Simon Templeman), un cazador del tesoro que ha contratado los servicios de mercenarios, liderados por Atoq Navarro (Robin Atkin Downes), un arqueólogo con el conocimiento de la estatua. Nathan se niega a ayudar a Gabriel, entonces este le dispara a Sully en el pecho, justo entonces Elena aparece para ayudar a Nathan. Los dos escapan rápidamente sin Sully en el avión para donde se cree que la estatua está ubicada.
Al acercarse a la isla, su avión es derribado, pero ambos saltan separados en paracaídas. Nathan lucha en la isla contra los mercenarios de Gabriel, y encuentra una cueva en donde se halla el paracaídas de Elena. Sin embargo él encuentra unas marcas que le conducen a la fortaleza donde se encuentran los mercenarios de Gabriel en el Diario de Drake y se da cuenta de que está en el camino correcto hacia la estatua de oro. Nathan y Elena se reagrupan y deben huir de Eddy y los mercenarios de Gabriel. Los dos trabajan juntos para llegar a una ciudad portuaria en donde descubren que la estatua se ha movido al interior de un monasterio. En el monasterio, Nathan una vez más utiliza el diario para localizar pasajes ocultos, Gabriel todavía los sigue, y al final hasta reunirse con Sully, que sobrevivió debido a que el diario había bloqueado la bala, y demuestra que él sigue siendo fiel a Nathan a pesar de que trabaja con los hombres de Gabriel. Sully permanece en una ubicación segura para ayudar a Nathan con la radio, Nathan y Elena llegan a un laberinto muy parecido a los pasajes subterráneos llevando a una gran bóveda del tesoro. Estos llegan a un callejón sin salida encuentra el cadáver de Sir Francis Drake asumiendo que él murió en la isla buscando el tesoro. Pero antes de pasar se encuentran con Eddy corriendo por su vida perseguido por mutantes con increíble fuerza y velocidad. Nathan y Eddy cooperan por el momento, finalmente Eddy es atacado dejando Nathan y Elena escapar, se encuentran en un submarino alemán abandonado construido en la isla. Nathan al restaurar la electricidad encuentra un rollo de película, en donde se muestra que describe como los alemanes durante La Segunda Guerra Mundial quedaron malditos por las estatua convirtiéndose en unos mutantes al igual que los españoles antaño. Nathan encuentra una carta escrita por Sir Francis Drake en donde el descubre que él no vino por la estatua como un tesoro sino para evitar que se la llevaran de la isla, por los efectos de propagación de esta, también descubre que Sir Francis fue asesinado por los mutantes españoles, después de destruir todos sus barcos para que no escaparan e inundar la colonia.
Nathan intenta volver a donde está Elena, a la que había dejado atrás esperándole, pero encuentra que ha sido capturada por Gabriel y Navarro. Nathan se abre camino para salir de la isla, a través de los mercenarios y los mutantes, con ayuda de Sully logra derrotarlos mientras estos cubre la salida de Gabriel a través de la antigua iglesia del monasterio. Encuentran que Gabriel ha encontrado la estatua, y como ven, Navarro insiste a Gabriel para que abra la estatua para ver su contenido, alegando que el verdadero tesoro se encuentra dentro. Gabriel lo hace, revelando al momificado "hombre de oro" de la leyenda. El polvo de la momia deriva de la estatua y cae en la cara de Gabriel, enloqueciéndolo y rápidamente causando que entre en una fase temprana de mutación, y es rápidamente asesinado a tiros por Navarro. Se suponía que Navarro había planeado esto desde el principio, y solicitó la estatua no por el oro, sino por la posibilidad de vender el mutágeno como un arma. Navarro, que aún tienen en cautividad a Elena, utiliza un helicóptero para levantar la estatua, a pesar de advertencias de que la estatua había aniquilado a toda la colonia. Nathan es capaz de saltar a la estatua antes de que el helicóptero pueda salir. Navarro rápidamente descubre a Nathan y ordena a sus hombres dispararle. Elena utiliza la oportunidad de patear al mercenario fuera del helicóptero, este al caer dispara su rifle, lo que resulta en la muerte del piloto. El helicóptero cae en un barco petrolero de Gabriel, lanzando a Nathan y Navarro a cierta distancia. Entonces Nathan se enfrenta a Navarro en una lucha final. Allí Nate noquea a Navarro y corre en ayuda de Elena en los restos del helicóptero que se cierne peligrosamente fuera del borde del buque. Sin embargo, Navarro ha recuperado la consciencia y se levantó. Pero las piernas de Navarro se enredan en el cable del helicóptero, Nathan aprovecha y lanza al helicóptero por la borda arrastrando a Navarro y a la estatua de El Dorado al fondo del mar.
Momentos más tarde, Sully llega en una pequeña lancha rápida, después de haber escapado de la isla y cogido varias cajas del tesoro que encontró en la cueva. Una vez a bordo, Elena recuerda a Nathan que por su culpa perdió su cámara y que él todavía le debe una historia. A medida que el barco navega hacia el horizonte, Nathan asegura que no romperá su promesa.
